Khi Chiến dịch Barbarossa bắt đầu ngày 22 tháng 6 năm 1941 chỉ Trung đoàn Ném bom Hạng nặng số 14 (TBAP — Tyazholy Bombardirovschik Aviapolk) được trang bị 9 chiếc TB-7 và nó vẫn chưa đi vào hoạt động.[16][17] Ngay sau khi chiến tranh bắt đầu Stalin đã ra lệnh tái lập trung đoàn để nó có thể tăng cường tinh thần cho người Liên Xô bằng cách tấn công các mục tiêu sâu trong lãnh thổ Đức. Trung đoàn được tái định danh thành Trung đoàn Ném bom Tầm xa số 412 (DBAP — Dahl'niy Bombardirovchnyy Aviapolk), sau này là DBAP 432, và bắt đầu huấn luyện cho các phi vụ tầm xa. Tối ngày 10 tháng 9 tám chiếc TB-7 trang bị động cơ M-40 của DBAP 432, được hộ tống bởi những chiếc Yermolaev Yer-2 của DBAP 420, đã tìm cách tấn công Berlin từ sân bay Pushkino gần Leningrad. Một chiếc TB-7 chở nặng bom đã đâm xuống đất ngay sau khi cất cánh vì mất một động cơ. Chỉ bốn chiếc tới được Berlin, hay vùng phụ cận của nó và chỉ hai chiếc TB-7 quay lại được căn cứ, những chiếc khác hạ cánh ở đâu đó hay hạ cánh khẩn cấp xuống Phần Lan và Estonia. Chiếc TB-7 của chỉ huy Sư đoàn Ném bom Tầm xa số 81, Thiếu tướng (Kombrig) Mikhail Vodopianov, mà cả hai trung đoàn đều trực thuộc, đã bị tấn công bởi những chiếc Polikarpov I-16 thuộc Không quân Hải quân Liên Xô trên Biển Baltic và sau đó bị hỏng một động cơ vì hoả lực phòng không trước khi tới được Berlin. Ông bị buộc phải quay lại sau khi một bình nhiên liệu bị bục và hạ cánh khẩn cấp xuống phía nam Estonia.[18] Năm chiếc TB-7 bị mất trong chiến dịch và những động cơ M-40 cho thấy hoàn toàn không đáng tin cậy.[19] Tổng cộng bảy chiếc TB-7 đã mất trong tháng 9, khiến trung đoàn hoàn toàn mất khả năng tác chiến. Trong giai đoạn này chiếc máy bay còn lại được tái trang bị các động cơ AM-35A, có tầm hoạt động ngắn hơn, nhưng có độ tin cậy cao hơn.[20]

Tới ngày 1 tháng 10 năm 1941 trung đoàn có 14 chiếc TB-7 sau khi được bổ sung thêm máy bay mới.[16] Trung đoàn thực hiện các cuộc tấn công ban đêm vào Berlin, Königsberg, Danzig và các thành phố khác trong mùa thu. Không chiếc máy bay nào được thông báo còn lại vào ngày 5 tháng 12, nhưng 11 chiếc đã được tăng cường vào ngày 18 tháng 3 năm 1942.[16] Trong mùa đông năm 1941–42 trung đoàn có nhiệm vụ phá huỷ một cầu đường sắt trên Sông Volga gần Kalinin. Tháng 4 năm 1942 một chiếc máy bay đã chở nhân viên ngoại giao và thư từ trên một chuyến bay thẳng từ Moscow tới Anh Quốc.[20] Đây là chuyến bay thử cho một chuyến bay chở Bộ trưởng ngoại giao Liên Xô Molotov và phái đoàn của ông từ Moscow tới London và Washington, D.C. và quay trở lại để thực hiện các cuộc đàm phán mở một mặt trận thứ hai chống Phát xít Đức (19 tháng 3-13 tháng 6 năm 1942), vượt qua không phận do Đức kiểm soát trong chuyến trở về mà không có vụ việc nào.[21] Từ tháng 8 năm 1941 tới tháng 5 năm 1942 trung đoàn đã thực hiện 226 lần xuất kích và ném 606 tấn bom. 14 chiếc thiệt hại, trong số đó 9 chiếc mất trong chiến đấu, và 17 chiếc TB-7 đã được cung cấp thay thế.[20] Tới ngày 1 tháng 5 năm 1942 chỉ còn 16 chiếc, nhưng mãi tới ngày 1 tháng bảy con số này mới tăng lên 17.[16]

Trung đoàn được tái tổ chức thành hai trung đoàn, DBAP số 746 và DBAP số 890 năm 1942 và họ được sử dụng để ném bom các trung tâm vận tải tại vùng hậu phương Đức như Orel, Bryansk, Kursk và Poltava. Cường độ hoạt động gia tăng và hai trung đoàn đã thực hiện số phi vụ trong riêng tháng 8 bằng tổng cộng tất cả các phi vụ của 10 tháng đầu tiên của cuộc chiến.[22] Tới trước cuộc phản công của Liên Xô tại Stalingrad, Chiến dịch Uranus ngày 8 tháng 11 các trung đoàn có 14 chiếc Pe-8,[16] dù các trung đoàn, khi ấy dưới sự chỉ huy của Sư đoàn Ném bom Hàng không Tầm xa số 45 (DBAD — Dal'nebombardirovochnyy Aviatsionnaya Diviziya), không tham gia vào Trận Stalingrad.[23]

Năm 1943 sân bay chính của sư đoàn nằm ở Kratovo, phía đông nam Moscow, và các trung đoàn ném bom các trung tâm vận tải, các sân bay và những nơi tập trung quân trong nửa đầu năm 1943. Sân ga tại Gomel là một mục tiêu được ưa thích và khoảng 606 tấn bom đã được ném xuống đây từ tháng 2 tới tháng 9 năm 1943, dù không rõ rằng có phải tất cả chúng đều do những chiếc Pe-8 thực hiện hay không. Ngoài ra loại bom FAB-5000 lần đầu tiên được sử dụng tại Königsberg tháng 4 năm 1943, tiếp tục các cuộc tấn công pin-prick chống lại các mục tiêu sâu trong hậu phương nước Đức.[22] Tháng 5 năm 1943 những nỗ lực được chuyển đổi nhằm tìm cách tiêu diệt việc xây dựng lực lượng của Đức cho Trận Kursk. Một ví dụ là khi DBAD số 45 tấn công đầu mối đường sắt tại Orsha trong buổi chiều ngày 4 tháng 5 với 109 máy bay ném bom, đa số chúng không phải là những chiếc Pe-8, phá huỷ 300 toa xe và ba đoàn tàu chở đạn dược, và đã được Bộ tổng tư lệnh Đức lưu ý.[24]

Trong phần đầu trận đánh, các đơn vị hàng không tầm xa tiếp tục tấn công các mục tiêu tại vùng hậu phương Đức vào ban đêm, nhưng nó tập trung vào việc hỗ trợ các lực lượng Liên Xô tiến hành phản công vào Orel Bulge, Chiến dịch Kutuzov, bắt đầu ngày 12 tháng 7. Người Đức đã chuyển đổi một nhóm máy bay chiến đấu ban đêmtừ Nachtjagdgeschwader 5 (IV./NJG 5), với cả những chiếc Junkers Ju 88 và Dornier Do 217 sang vùng Orel trước khi bắt đầu trận đánh để chống lại những cuộc oanh tạc thường xuyên vào các tuyến đường sắt và cơ sở hậu cần của Đức, nhưng chúng rõ ràng không hiệu quả cho tới khi các radar mặt đất được triển khai. Điều này diễn ra tới tận tối ngày 17–18 tháng 7 và thiệt hại của Liên Xô tăng lên nhanh chóng khi người Đức chỉ cho thực hiện 14 lần xuất kích trong đêm đó, nhưng đã tuyên bố bắn hạ tám chiếc. Ba chiếc Pe-8 mất trong đêm 20-21 tháng 7, một vì súng của Hauptmann Heinrich Prinz zu Sayn-Wittgenstein, chỉ huy IV./NJG 5.[25] Đây là một tỷ lệ rất cao trên tổng số chỉ 18 chiếc hoạt động ở thời điểm ngày 1 tháng 7.[16] Điều này cũng có thể bởi các vấn đề về ống thoát khí của ASh-82 là rõ ràng bởi chúng không có các ống thoát chống cháy.[22]

Đây là một điềm báo bởi tỷ lệ thiệt hại, vì mọi nguyên nhân, với chiếc Pe-8 tăng đều từ một chiếc trên 103 lần xuất kích năm 1942 tới một chiếc trên 46 lần xuất kích năm 1944.[26] Dù vậy số lượng máy bay của DBAD số 45 tiếp tục tăng; hai mươi chiếc sẵn sàng ngày 1 tháng 1 năm 1944 và 30 ngày 1 tháng 7.[16] Những chiếc Pe-8 đã thực hiện 276 lần xuất kích năm 1944 tấn công các mục tiêu như Helsinki, Tallinn và Pskov. Yefim Gordon cho rằng chiếc Pe-8 thực hiện phi vụ cuối cùng đêm ngày 1–2 tháng 8 năm 1944,[26] nhưng điều này rõ ràng trái ngược với Tài liệu Thống kê của Không quân Liên Xô cho thấy 31 chiếc Pe-8 thuộc sự điều khiển của DBAD số 45 ngày 1 tháng 1 năm 1945 và 32 chiếc ngày 10 tháng 5 năm 1945.[16]